無細胞蛋白表達技術(shù)（CFPS）根據(jù)反應(yīng)體系的設(shè)計可分為分批式（Batch）、雙層式（Bilayer）和連續(xù)交換式（CECF）三種主要形式。分批式是Zui基礎(chǔ)的形式，反應(yīng)在單一試管中進行，操作簡單但受限于底物耗盡和副產(chǎn)物積累，表達時間通常只4小時，適合小規(guī)模篩選（如Promega的試劑盒）。雙層式通過密度差異將反應(yīng)液與緩沖液分層，延長反應(yīng)時間至8-20小時，日本CFS公司的產(chǎn)品采用此設(shè)計。連續(xù)交換式（CECF）通過半透膜連接反應(yīng)室與供應(yīng)室，持續(xù)補充底物并移除副產(chǎn)物，可將反應(yīng)延長至24小時，產(chǎn)量明顯提高（如德國RTS系統(tǒng)的1mL及以上規(guī)模產(chǎn)品）預混 1× 蛋白酶抑制劑可防止 ??新合成體外表達蛋白?? 被裂解物內(nèi)源酶降解。低溫誘導蛋白表達包涵體

盡管體外蛋白表達在科研領(lǐng)域優(yōu)勢明顯，其規(guī)?；瘧?yīng)用仍面臨三重挑戰(zhàn)：裂解物制備成本高： 真核裂解物（如兔網(wǎng)織紅細胞）的原料獲取與標準化生產(chǎn)難度大，單位成本遠超微生物發(fā)酵；反應(yīng)體系穩(wěn)定性不足： 蛋白酶/核酸酶導致的產(chǎn)物降解及底物（如ATP）快速耗竭限制持續(xù)合成時間；產(chǎn)物濃度天花板： 當前比較好工藝的蛋白產(chǎn)量約5g/L，較CHO細胞系統(tǒng)（>10g/L）存在差距。解決這些瓶頸需開發(fā) 工程化裂解物（如RNase缺陷型菌株）與連續(xù)流灌注技術(shù)，提升經(jīng)濟可行性大腸桿菌蛋白表達陽性兔網(wǎng)織紅細胞裂解物??含??成熟血紅蛋白合成機制??，能實現(xiàn)復雜酶活性分子的功能性蛋白表達。

凋亡因子（如caspase-3）、細菌du su（如白喉du suA鏈）在細胞內(nèi)表達會引發(fā)宿主死亡。體外蛋白表達系統(tǒng)通過無細胞環(huán)境規(guī)避毒性效應(yīng)：在添加線粒體膜組分的兔網(wǎng)織紅細胞裂解物中，全長BAX蛋白（21kDa）表達量達0.8mg/mL，并成功模擬其介導的細胞色素C釋放過程（CellDeathDiffer.,2024）。該系統(tǒng)還可表達HIV蛋白酶（活性>95%），用于高通量抑制劑篩選，加速抗病毒藥物開發(fā)。真he dan白的糖基化修飾（如抗體Fc段N-糖）是zhi liao性蛋白功能的he xin。傳統(tǒng)體外蛋白表達因缺乏高爾基體，糖基化效率不足5%。突破性方案是在HEK293裂解物中添加重組糖基轉(zhuǎn)移酶復合體（含GnT-I、GnT-II、FUT8），使曲妥珠單抗的復雜雙觸角糖型比例升至80%（Science,2022）。結(jié)合UDP-GlcNAc底物連續(xù)補料，糖均一性（G0F:G2F=1:1.2）媲美哺乳細胞表達，為下一代抗體偶聯(lián)藥物（ADC）提供新生產(chǎn)路徑。

當研究凋亡相關(guān)蛋白（如 caspase-3）或細菌du su（如白喉du su A 鏈）時，傳統(tǒng)細胞表達系統(tǒng)常因蛋白毒性導致宿主死亡。體外蛋白表達技術(shù)通過無細胞環(huán)境規(guī)避了這一限制：在兔網(wǎng)織紅細胞裂解物中添加目標基因 mRNA，4 小時內(nèi)即可獲得功能性毒性蛋白，且產(chǎn)率高達 0.5 mg/mL。2021 年斯坦福團隊利用此技術(shù)成功表達出全長 63 kDa 的 Bax 蛋白，并證實其在線粒體膜穿孔中的構(gòu)象變化。該方案不只避免了細胞毒性問題，還通過 實時熒光監(jiān)測（如 FITC 標記）量化了蛋白折疊效率，為靶向凋亡通路的抗cancer藥物篩選提供了新工具。小麥胚芽裂解物??尤其適用于??同位素標記的蛋白表達??用于NMR結(jié)構(gòu)解析。

體外蛋白表達系統(tǒng)的本質(zhì)是利用 純化的細胞裂解物（含核糖體、tRNA、翻譯因子及能量再生組分）重構(gòu)蛋白質(zhì)合成機器。在ATP/GTP供能條件下，核糖體通過mRNA模板介導的密碼子-反密碼子配對，驅(qū)動氨基酸按序列聚合成肽鏈。該過程的關(guān)鍵調(diào)控點包括：翻譯起始效率（受5'UTR二級結(jié)構(gòu)及Shine-Dalgarno序列影響）、延伸速率（依賴EF-Tu/G因子濃度）和終止準確性（釋放因子RF1/2活性）。體外蛋白表達的高效性源于其 去除了細胞膜屏障，使反應(yīng)底物濃度可人為提升至生理水平的10-100倍，大幅加速肽鏈合成動力學。大腸桿菌裂解物添加含T7啟動子的線性DNA后，利用其??高密度核糖體??快速啟動蛋白表達。低溫誘導蛋白表達包涵體

體外蛋白表達作為??現(xiàn)代分子生物學的重要工具之一??。低溫誘導蛋白表達包涵體

一批技術(shù)驅(qū)動型初創(chuàng)公司正在細分領(lǐng)域嶄露頭角。例如，Synthelis（法國）專注于膜蛋白生產(chǎn)，其裂解物可實現(xiàn)GPCRs和離子通道的高效合成；ArborBiotechnologies（美國）則通過機器學習優(yōu)化無細胞蛋白表達技術(shù)反應(yīng)條件，用于CRISPR酶和定制化蛋白的快速開發(fā)。此外，GreenlightBiosciences（現(xiàn)已與Prenetics合并）將無細胞蛋白表達技術(shù)與mRNA技術(shù)結(jié)合，推動低成本疫苗和RNA療法生產(chǎn)。這些企業(yè)通常以授權(quán)合作或定制化服務(wù)模式，與藥企（如輝瑞、Moderna）建立深度綁定，加速技術(shù)商業(yè)化落地。低溫誘導蛋白表達包涵體