體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)的明顯缺陷在于 缺乏真核細(xì)胞器結(jié)構(gòu),導(dǎo)致關(guān)鍵翻譯后修飾難以實現(xiàn):糖基化不完整性: 裂解物中缺乏高爾基體轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制,只能生成高甘露糖型等簡單糖鏈,無法合成復(fù)雜雙觸角N-糖;磷酸化/乙?;Ш猓?激酶/磷酸酶網(wǎng)絡(luò)不完整,使信號通路蛋白的修飾狀態(tài)與生理條件差異明顯;二硫鍵錯配風(fēng)險: 氧化還原環(huán)境調(diào)控不足導(dǎo)致多二硫鍵蛋白錯誤折疊率升高。這些局限使體外蛋白表達(dá)在 zhi liao性抗體等需精確修飾的蛋白生產(chǎn)中應(yīng)用受限。兔網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物??含??成熟血紅蛋白合成機(jī)制??,能實現(xiàn)復(fù)雜酶活性分子的功能性蛋白表達(dá)。常用蛋白表達(dá)方法
無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)的模板可以是線性DNA(如PCR產(chǎn)物)或環(huán)狀質(zhì)粒,需包含啟動子(如T7/T3/SP6)和核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)以啟動轉(zhuǎn)錄翻譯。為提升效率,系統(tǒng)可能添加分子伴侶(如DnaK/GroEL)輔助蛋白折疊,或氧化還原劑(如谷胱甘肽)促進(jìn)二硫鍵形成。部分高級系統(tǒng)(如PURE體系)使用純化重組元件替代粗提物,實現(xiàn)更高可控性,但成本較高。無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可靈活引入非天然氨基酸(nnAA),擴(kuò)展了蛋白質(zhì)的功能多樣性。例如,通過定制tRNA和氨酰-tRNA合成酶,無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)系統(tǒng)能準(zhǔn)確將熒光標(biāo)記或交聯(lián)基團(tuán)嵌入目標(biāo)蛋白,用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)或藥物偶聯(lián)開發(fā)。更前沿的應(yīng)用是人工生命體系的構(gòu)建,如利用無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)合成噬菌體或人工細(xì)胞雛形,結(jié)合微流控技術(shù)模擬細(xì)胞內(nèi)代謝網(wǎng)絡(luò),為合成生物學(xué)研究提供可控的簡化模型。分泌型蛋白表達(dá)市場現(xiàn)狀體外蛋白表達(dá)需使用??不含質(zhì)粒骨架的模板??以避免副反應(yīng)。
無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)(CFPS)根據(jù)反應(yīng)體系的設(shè)計可分為分批式(Batch)、雙層式(Bilayer)和連續(xù)交換式(CECF)三種主要形式。分批式是Zui基礎(chǔ)的形式,反應(yīng)在單一試管中進(jìn)行,操作簡單但受限于底物耗盡和副產(chǎn)物積累,表達(dá)時間通常只4小時,適合小規(guī)模篩選(如Promega的試劑盒)。雙層式通過密度差異將反應(yīng)液與緩沖液分層,延長反應(yīng)時間至8-20小時,日本CFS公司的產(chǎn)品采用此設(shè)計。連續(xù)交換式(CECF)通過半透膜連接反應(yīng)室與供應(yīng)室,持續(xù)補(bǔ)充底物并移除副產(chǎn)物,可將反應(yīng)延長至24小時,產(chǎn)量明顯提高(如德國RTS系統(tǒng)的1mL及以上規(guī)模產(chǎn)品)
盡管體外蛋白表達(dá)在科研領(lǐng)域優(yōu)勢明顯,其規(guī)?;瘧?yīng)用仍面臨三重挑戰(zhàn):裂解物制備成本高: 真核裂解物(如兔網(wǎng)織紅細(xì)胞)的原料獲取與標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)難度大,單位成本遠(yuǎn)超微生物發(fā)酵;反應(yīng)體系穩(wěn)定性不足: 蛋白酶/核酸酶導(dǎo)致的產(chǎn)物降解及底物(如ATP)快速耗竭限制持續(xù)合成時間;產(chǎn)物濃度天花板: 當(dāng)前比較好工藝的蛋白產(chǎn)量約5g/L,較CHO細(xì)胞系統(tǒng)(>10g/L)存在差距。解決這些瓶頸需開發(fā) 工程化裂解物(如RNase缺陷型菌株)與連續(xù)流灌注技術(shù),提升經(jīng)濟(jì)可行性??scFv 抗體片段的體外蛋白表達(dá)??在4小時內(nèi)完成,較傳統(tǒng)CHO 細(xì)胞系統(tǒng)提速 10 倍。
體外蛋白表達(dá)系統(tǒng)的本質(zhì)是利用 純化的細(xì)胞裂解物(含核糖體、tRNA、翻譯因子及能量再生組分)重構(gòu)蛋白質(zhì)合成機(jī)器。在ATP/GTP供能條件下,核糖體通過mRNA模板介導(dǎo)的密碼子-反密碼子配對,驅(qū)動氨基酸按序列聚合成肽鏈。該過程的關(guān)鍵調(diào)控點(diǎn)包括:翻譯起始效率(受5'UTR二級結(jié)構(gòu)及Shine-Dalgarno序列影響)、延伸速率(依賴EF-Tu/G因子濃度)和終止準(zhǔn)確性(釋放因子RF1/2活性)。體外蛋白表達(dá)的高效性源于其 去除了細(xì)胞膜屏障,使反應(yīng)底物濃度可人為提升至生理水平的10-100倍,大幅加速肽鏈合成動力學(xué)。例如HIV蛋白酶在通過體外蛋白表達(dá)后仍切割底物蛋白,但其毒性被限制在封閉體系內(nèi)。膜蛋白表達(dá)發(fā)展前景
大腸桿菌體外蛋白表達(dá)的單次反應(yīng)成本($1.5)只為哺乳細(xì)胞系統(tǒng)的 1/50。常用蛋白表達(dá)方法
無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在快速響應(yīng)公共衛(wèi)生事件和jun shi應(yīng)用中表現(xiàn)突出。例如,在COVID-19期間,無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)被用于數(shù)小時內(nèi)合成病毒抗原,加速疫苗候選物篩選。美國DARPA支持的“生物制造”項目利用凍干無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)試劑,在戰(zhàn)場環(huán)境中按需生產(chǎn)止血蛋白或抗體,實現(xiàn)便攜式、無需冷鏈的即時生物制造。這類場景凸顯了無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)在時效性和環(huán)境適應(yīng)性上的不可替代性。根據(jù)應(yīng)用需求,無細(xì)胞蛋白表達(dá)技術(shù)可整合非天然氨基酸(通過修飾tRNA)、脂質(zhì)體(用于膜蛋白表達(dá))或翻譯后修飾酶(如糖基化酶)。常用蛋白表達(dá)方法